Η εφαρμογή του RT-PCR σε πραγματικό χρόνο στο Covid-19

Τι είναι σε πραγματικό χρόνο RT-PCR;

Προσθέτοντας φθορισμού γονίδια στο σύστημα αντίδρασης PCR, χρησιμοποιώντας τη συσσώρευση σήματος φθορισμού για την παρακολούθηση ολόκληρης της διαδικασίας PCR σε πραγματικό χρόνο, και στη συνέχεια ποσοτικοποίηση του άγνωστου προτύπου μέσω μιας τυπικής καμπύλης ονομάζεται σε πραγματικό χρόνο φθορισμού ποσοτική τεχνολογία PCR, επίσης γνωστή ως σε πραγματικό χρόνο Q-PCR.

Η αρχή της ενίσχυσης PCR είναι η ίδια με εκείνη του συνηθισμένου οργάνου PCR, εκτός από το ότι οι εγχυτήρες που προστίθενται κατά τη διάρκεια της ενίσχυσης PCR επισημαίνονται με ισότοπα, φθορεσκεΐνη, κ.λπ., και τα αστάρια και οι φθορισμού ανιχνευτές χρησιμοποιούνται για να συνδεθούν ειδικά με το πρότυπο για την ενίσχυση ταυτόχρονα.

Τα ενισχυμένα αποτελέσματα συλλέγονται και μεταδίδονται στο σύστημα ανάλυσης και επεξεργασίας του υπολογιστή μέσω του σήματος συλλογής σε πραγματικό χρόνο του συστήματος συλλογής σημάτων φθορισμού για την επίτευξη ποσοτικής απόδοσης αποτελέσματος σε πραγματικό χρόνο.

Σε πραγματικό χρόνο RT-PCR είναι μία από τις πιο ευρέως χρησιμοποιούμενες εργαστηριακές μεθόδους για την ανίχνευση του ιού COVID-19. Ενώ πολλές χώρες έχουν χρησιμοποιήσει σε πραγματικό χρόνο RT-PCR για τη διάγνωση άλλων ασθενειών, όπως ο ιός Έμπολα και ο ιός Ζίκα, πολλές χρειάζονται υποστήριξη για την προσαρμογή αυτής της μεθόδου για τον ιό COVID-19, καθώς και για την αύξηση των εθνικών ικανοτήτων δοκιμών τους.

Πώς λειτουργεί σε πραγματικό χρόνο RT-PCR με τον ιό COVID-19;

Ένα δείγμα συλλέγεται από τα μέρη του σώματος όπου συγκεντρώνεται ο ιός COVID-19, όπως η μύτη ή ο λαιμός ενός ατόμου. Το δείγμα αντιμετωπίζεται με διάφορα χημικά διαλύματα που αφαιρούν ουσίες όπως πρωτεΐνες και λίπη και εξάγουν μόνο το RNA που υπάρχει στο δείγμα. Αυτό το εκχυλισμένο RNA είναι ένα μίγμα του γενετικού υλικού του ατόμου και, εάν υπάρχει, rna του ιού.

Το RNA είναι αντίστροφη μεταγράφηκε στο DNA χρησιμοποιώντας ένα συγκεκριμένο ένζυμο. Στη συνέχεια, οι επιστήμονες προσθέτουν επιπλέον σύντομα θραύσματα DNA που συμπληρώνουν συγκεκριμένα μέρη του μεταγλωττισμένου ιικού DNA. Εάν ο ιός είναι παρών σε ένα δείγμα, αυτά τα θραύσματα προσκολλώνται σε τμήματα-στόχους του ιικού DNA. Μερικά από τα πρόσθετα γενετικά θραύσματα χρησιμοποιούνται για την οικοδόμηση των κλώνων DNA κατά τη διάρκεια της ενίσχυσης, ενώ τα άλλα χρησιμοποιούνται για την οικοδόμηση του DNA και την προσθήκη ετικετών δεικτών στα σκέλη, τα οποία χρησιμοποιούνται έπειτα για να ανιχνεύσουν τον ιό.

Το μείγμα τοποθετείται στη συνέχεια σε μια μηχανή RT-PCR. Η μηχανή περνά μέσα από θερμοκρασίες που θερμαίνουν και δροσίζουν το μείγμα για να προκαλέσουν συγκεκριμένες χημικές αντιδράσεις που δημιουργούν νέα, πανομοιότυπα αντίγραφα των τμημάτων-στόχων του ιικού DNA. Ο κύκλος επαναλαμβάνεται ξανά και ξανά για να συνεχίσει την αντιγραφή των τμημάτων-στόχων του ιικού DNA. Κάθε κύκλος διπλασιάζει τον προηγούμενο αριθμό: δύο αντίγραφα γίνονται τέσσερα, τέσσερα αντίγραφα γίνονται οκτώ, και ούτω καθεξής. Ένα πρότυπο σε πραγματικό χρόνο RT-PCR set-up περνά συνήθως από 35 κύκλους, πράγμα που σημαίνει ότι, μέχρι το τέλος της διαδικασίας, περίπου 35 δισεκατομμύρια νέα αντίγραφα των τμημάτων του ιικού DNA δημιουργούνται από κάθε σκέλος του ιού που υπάρχει στο δείγμα.

Καθώς κατασκευάζονται νέα αντίγραφα των τμημάτων του ιικού DNA, οι ετικέτες των δεικτών συνδέονται με τα σκέλη του DNA και στη συνέχεια απελευθερώνουν μια φθορισμού χρωστική ουσία, η οποία μετριέται από τον υπολογιστή του μηχανήματος και παρουσιάζεται σε πραγματικό χρόνο στην οθόνη. Ο υπολογιστής παρακολουθεί την ποσότητα του φθορισμού στο δείγμα μετά από κάθε κύκλο. Όταν ένα ορισμένο επίπεδο φθορισμού έχει ξεπεραστεί, αυτό επιβεβαιώνει ότι ο ιός είναι παρών. Οι επιστήμονες παρακολουθούν επίσης πόσους κύκλους χρειάζεται για να φτάσει σε αυτό το επίπεδο, προκειμένου να εκτιμηθεί η σοβαρότητα της λοίμωξης: όσο λιγότεροι είναι οι κύκλοι, τόσο πιο σοβαρή είναι η ιογενής λοίμωξη.

Γιατί να χρησιμοποιήσετε σε πραγματικό χρόνο RT-PCR;

Η τεχνική RT-PCR σε πραγματικό χρόνο είναι εξαιρετικά ευαίσθητη και συγκεκριμένη και μπορεί να προσφέρει μια αξιόπιστη διάγνωση σε μόλις τρεις ώρες, αν και τα εργαστήρια λαμβάνουν κατά μέσο όρο μεταξύ έξι και οκτώ ωρών. Σε σύγκριση με άλλες διαθέσιμες μεθόδους απομόνωσης του ιού, σε πραγματικό χρόνο RT-PCR είναι σημαντικά ταχύτερη και έχει μικρότερη πιθανότητα μόλυνσης ή σφαλμάτων, καθώς η όλη διαδικασία μπορεί να πραγματοποιηθεί μέσα σε ένα κλειστό σωλήνα. Εξακολουθεί να είναι η πιο ακριβής διαθέσιμη μέθοδος για την ανίχνευση του ιού COVID-19.

Ωστόσο, σε πραγματικό χρόνο RT-PCR δεν μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την ανίχνευση λοιμώξεων του παρελθόντος, η οποία είναι σημαντική για την κατανόηση της ανάπτυξης και της εξάπλωσης του ιού, καθώς οι ιοί είναι παρόντες στο σώμα μόνο για ένα συγκεκριμένο χρονικό διάστημα. Άλλες μέθοδοι είναι απαραίτητες για την ανίχνευση, την παρακολούθηση και τη μελέτη των λοιμώξεων του παρελθόντος, ιδιαίτερα εκείνων που μπορεί να έχουν αναπτυχθεί και να εξαπλωθεί χωρίς συμπτώματα.